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Proimmune
產(chǎn)品時間：2020-05-16
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掌握免疫
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嵌合A2KbPro5®MHC I類五聚體
轉(zhuǎn)基因小鼠模型已成為評估假定的人類抗原疫苗接種的重要工具。HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠表達結(jié)合了HLA-A * 02：01的alpha-1和alpha-2結(jié)構(gòu)域與H-2Kb的alpha-3結(jié)構(gòu)域的修飾的I類MHC分子。
為了研究在這種小鼠中的細胞毒性T細胞免疫應(yīng)答，已經(jīng)提出可以使用嵌合的A2Kb多聚體以便準確地檢測相關(guān)的免疫應(yīng)答。
生物素標記的Pro5®Pentamers和Pro5®Biotag
生物素標記的五聚體的多種應(yīng)用
生物素標記的Pro5®MHC I類五聚體允許枚舉和分離抗原特異性CD8 + T淋巴細胞。多聚體MHC-肽復(fù)合物結(jié)合特定特異性的T細胞受體（TCR），如MHC等位基因和肽組合所確定的?？梢酝ㄟ^流式細胞術(shù)分析用生物素標記的Pro5®Pentamers染色的CD8 + T細胞，然后用熒光鏈霉親和素偶聯(lián)物染色，以確定抗原特異性T細胞的頻率。
通過使用鏈霉親和素包被的磁性微珠，生物素標記的五聚體也可以用于分離或消除抗原特異性CD8 + T細胞。如果需要獲得活細胞用于進一步分析，例如T細胞培養(yǎng)或基因表達譜分析，則以這種方式分離抗原特異性T細胞非常有用。生物素標記的五聚體也可用于基于板的測定（如ELISA）中，可將其固定在鏈霉親和素包被的表面上。
Pro5®Biotag是一種生物素標簽蛋白，可與未標記的Pro5®Pentamers特異性結(jié)合，可作為輔助試劑用于流式細胞儀分析。可以通過流式細胞術(shù)分析用五聚體加Pro5 Biotag結(jié)合選擇的熒光標記的鏈霉親和素綴合物染色的CD8 + T細胞，并確定抗原特異性T細胞的頻率。因此，將Biotag與未標記的五聚體一起使用可提高實驗靈活性，并增強Pentamer染色的應(yīng)用能力。
應(yīng)用：流式細胞術(shù)
可以通過流式細胞術(shù)分析用生物素標記的五聚體與選擇的熒光標記的鏈霉親和素結(jié)合物染色的CD8 + T細胞，以確定抗原特異性T細胞的頻率。多種與鏈霉親和素結(jié)合的熒光染料可與生物素標記的五聚體一起使用，從而在多通道流式細胞儀染色實驗中增加了靈活性。
下圖顯示了示例性染色，其中使用B * 08：01 / RAKFKQLL（EBV BZLF-1）特異性生物素標記的Pentamer，然后用SA-PE，SA-PerCP或SA染色1 x 106個外周血細胞-PE Cy5。即使每個熒光標記的熒光強度都不相同，也可以實現(xiàn)相似程度的抗原特異性染色。
應(yīng)用：分離T細胞
使用生物素標記的五聚體與鏈霉親和素包被的順磁珠結(jié)合，可以輕松分離或清除抗原特異性CD8 + T細胞。ProImmune的生物素標記五聚體適用于任何微珠系統(tǒng)和微珠供應(yīng)商，這意味著它們可與現(xiàn)有試劑和設(shè)備一起使用。如果需要獲得活細胞用于進一步培養(yǎng)或分析（例如表達譜分析），則以這種方式分離抗原特異性T細胞很有用。
下圖顯示了使用B * 08：01 / RAKFKQLL（EBV BZLF-1）特異性生物素標記的Pentamer從外周血懸浮液中清除抗原特異性細胞的過程。將原始細胞群（耗盡前）和分離后（耗盡后）上清液的樣品與抗CD8-FITC抗體和SA-PE孵育，以觀察抗原特異性細胞。抗原特異性種群從1.53％減少到0.04％，證實了EBV BZLF-1細胞的珠分離成功。
應(yīng)用：培養(yǎng)細胞的擴增
人工抗原呈遞已經(jīng)成為刺激和擴增培養(yǎng)細胞的重要工具。生物素標記的五聚體可與>2μm鏈霉親和素標記的順磁珠偶聯(lián)，并與共刺激抗體（如生物素化的抗CD28和抗CD40抗體）結(jié)合使用，以在體外刺激單個抗原特異性T細胞。
應(yīng)用：免疫分析
可以將生物素標記的五聚體固定在任何抗生蛋白鏈菌素包被的表面上，以用于體外測定，例如基于板的ELISA。五聚體特別適用于該實驗平臺，因為分子的擴展方向結(jié)構(gòu)意味著提供/提供了高拷貝數(shù)的MHC分子。
在下圖中，用A * 02：01特異性生物素標記的Pentamer的系列稀釋液包被了96孔ELISA板。通過加入抗A * 02：01構(gòu)象抗體，然后加入抗小鼠Ig-HRP和TMB（3,3'，5,5'–四甲基聯(lián)苯胺），可以觀察結(jié)合的五聚體。在450nm處讀取板，并且該圖顯示了五聚體濃度相對于吸光度。
ELISA固定化生物素化的Pro5®MHC I類五聚體
通訊協(xié)定
生物素標記的Pro5®MHC Pentamer的細胞染色方案（2層染色）
所需材料
洗滌緩沖液（0.1％疊氮化NA，0.1％BSA的PBS溶液），固定液（1％胎牛血清，2.5％的甲醛的PBS溶液），對所選抗原具有特異性的生物素標記的Pro5®Pentamer，熒光標記的鏈霉親和素綴合物，抗CD8抗體（與鏈霉親和素偶聯(lián)物的熒光不同）。
每個染色條件分配1-2 x 10 6個淋巴樣細胞（PBMC或脾細胞）。（ 由于抗原特異性T細胞的頻率高，使用T細胞克隆或品系時，每個染色條件只能分配2-5 x 10 5個細胞）。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，并將其重懸于剩余體積（?50μl）中。
每個染色條件添加一個測試（10μl）生物素標記的五聚體。
在室溫下孵育10 – 15分鐘。
用10倍體積的洗滌緩沖液洗滌細胞。
每個染色條件添加jia滴定量的熒光標記的鏈霉親和素和抗CD8抗體。
在黑暗中于冰上孵育2030分鐘。
將細胞在洗滌緩沖液中洗滌兩次，并在黑暗中保存在固定溶液中。
現(xiàn)在，細胞已準備好進行流式細胞儀分析。通過先在活淋巴樣細胞上進行門控，然后在雙色圖上進行分析，在X軸上顯示CD8，在y軸上顯示Pentamer，可以方便地查看Pentamer陽性細胞。
未標記的Pro5®MHC Pentamer plus Biotag的細胞染色方案（三層染色）
所需材料
洗滌緩沖液（0.1％疊氮化na，0.1％BSA的PBS溶液），固定液（1％胎牛血清，2.5％的甲醛的PBS溶液），針對所選抗原的未標記Pro5®Pentamer，Pro5®Biotag，熒光標記的鏈霉親和素偶聯(lián)物，抗CD8抗體（與鏈霉親和素偶聯(lián)物的熒光不同）。
每個染色條件分配1-2 x 10 6個淋巴樣細胞（PBMC或脾細胞）。（ 由于抗原特異性T細胞的頻率高，使用T細胞克隆或品系時，每個染色條件只能分配2-5 x 10 5個細胞）。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，并將其重懸于剩余體積（?50μl）中。
每個染色條件添加一個測試（2μl）未標記的五聚體。
在室溫下孵育10 – 15分鐘。
用10倍體積的洗滌緩沖液洗滌細胞。
添加一個測試（8μl）Pro5®Biotag。
在冰上孵育2030分鐘。
每個染色條件添加jia滴定量的熒光標記的鏈霉親和素和抗CD8抗體。
在黑暗中于冰上孵育2030分鐘。
將細胞在洗滌緩沖液中洗滌兩次，并在黑暗中保存在固定溶液中。
現(xiàn)在，細胞已準備好進行流式細胞儀分析。通過先在活淋巴樣細胞上進行門控，然后在雙色圖上進行分析，在X軸上顯示CD8，在y軸上顯示Pentamer，可以方便地查看Pentamer陽性細胞。
磁珠隔離協(xié)議
所需材料
洗滌緩沖液（0.1％疊氮化na，0.1％BSA的PBS溶液），抗生蛋白鏈菌素珠（例如，來自Polymer Labs的Lodestars 2.7抗生蛋白鏈菌素；來自Dynal Biotech的Dynabeads M-280抗生蛋白鏈菌素）。為了獲得jia結(jié)果，少應(yīng)使用1 x 10 7個 淋巴樣細胞（PBMC或脾細胞）。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，并重懸于200ml洗滌緩沖液中。
每2 x 10 6個 細胞添加1個測試（10μl）生物素標記的Pentamer 。
在室溫下孵育10分鐘。
用洗滌緩沖液洗滌細胞，然后重懸于500μl洗滌緩沖液中。
加入適量的鏈霉親和素珠子（建議每細胞少5個珠子）。
在冰上混合孵育30分鐘。
用洗滌緩沖液將試管中的體積增加2 ml，然后放入磁性顆粒分離器中。
靜置3-5分鐘。如果需要，可以保留上清液用于流式細胞儀分析，以確認已去除抗原特異性細胞。
用洗滌緩沖液洗滌含珠細胞復(fù)合物的部分3次，棄去上清液。
分離的珠細胞復(fù)合物可置于細胞培養(yǎng)物中，珠子應(yīng)在幾天后解離。
固體表面固定方案
所需材料
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），鏈霉親和素，0.1M碳酸氫鈉（NaHCO3），Tween-20，牛血清白蛋白（BSA）。
通過在0.1 M NaHCO3（pH 8.2）中于4ºC孵育過夜，以100 ng /孔的抗生蛋白鏈菌素（100μl/孔的96孔ELISA板）覆蓋固體表面（例如ELISA板）。
用PBS / 0.05％Tween-20清洗表面3次。
用5％BSA / PBS（200μl/孔的96孔ELISA板）封閉，并在室溫下孵育1小時。
用PBS / 0.05％Tween-20清洗表面3次。
加入50ng /孔生物素標記的Pentamer（或根據(jù)需要滴定），并在室溫下孵育1小時。
用PBS / 0.05％Tween-20清洗表面3次，然后進行所需的測定。
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