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細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和蛋白質(zhì)生產(chǎn)

使用基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)制備富含同位素的蛋白質(zhì)是制備用于 NMR 分析的樣品的常用方法。迄今為止，用于表達(dá)標(biāo)記蛋白的流行的生物體是大腸桿菌。哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞用于表達(dá)蛋白質(zhì)。大腸桿菌不能以可用的形式表達(dá)蛋白質(zhì)。

CIL 提供了一系列豐富的試劑和產(chǎn)品來標(biāo)記大腸桿菌、昆蟲、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以生產(chǎn)適用于 NMR 實(shí)驗(yàn)的均勻或選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)。

細(xì)菌培養(yǎng)基

使用 e. 蛋白的過度表達(dá)。大腸桿菌是獲得標(biāo)記蛋白質(zhì)用于 NMR 研究的流行方法。這是通過增加 e 來實(shí)現(xiàn)的。大腸桿菌細(xì)胞并在適當(dāng)?shù)母缓凰氐募?xì)胞培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)?；九囵B(yǎng)基是僅包含葡萄糖或甘油或丙酮酸作為表達(dá)蛋白質(zhì)的碳源和氯化銨或硫酸銨作為氮源的細(xì)胞培養(yǎng)基。豐富的培養(yǎng)基含有氨基酸以及用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的一定水平的葡萄糖。

CIL 提供多種產(chǎn)品，用于表達(dá)用于 NMR 研究的標(biāo)記蛋白質(zhì)。這些包括用于基本培養(yǎng)基的試劑以及可直接使用或用水稀釋后即可使用的豐富細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基。CIL 還提供 Celtone 粉末，一種標(biāo)記添加劑，用于基本培養(yǎng)基以及 Spectra 9 培養(yǎng)基，一種基本培養(yǎng)基，每升含有 1 克 Celtone 粉末。CIL 也銷售 e。由位于德國(guó)慕尼黑的 Silantes Gmbh 公司生產(chǎn)的大腸桿菌 OD 培養(yǎng)基。

昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基

將桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (BEVS) 用于在同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞已被證明是生產(chǎn)同位素標(biāo)記膜蛋白，最顯著的是 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 的成熟技術(shù)。CIL 自豪地開創(chuàng)了一種化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基已用于草地夜蛾 (SF9) 細(xì)胞。這種培養(yǎng)基 BioExpress 2000® 可以用統(tǒng)一標(biāo)記或氨基酸特異性標(biāo)記制造。未標(biāo)記的試驗(yàn)尺寸可用于在使用標(biāo)記介質(zhì)之前檢查可行性和優(yōu)化。請(qǐng)參閱 CIL 應(yīng)用說明 14（“使用 BioExpress2000®（昆蟲細(xì)胞）培養(yǎng)基對(duì)桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行有效均勻同位素標(biāo)記"）和 20（“有效位點(diǎn)特異性同位素標(biāo)記（13C15N 甘氨酸；13C15N苯丙氨酸；15N 色氨酸）使用 BioExpress2000® 培養(yǎng)基進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化"）以獲取更多信息。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基

隨著目標(biāo)蛋白質(zhì)的大小和復(fù)雜性增加，獲得在大腸桿菌中表達(dá)的正確折疊蛋白質(zhì)的可能性。大腸桿菌減少。然后必須轉(zhuǎn)向使用真核細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系通常是選擇。CIL 自豪地提供 BioExpress 6000®，這是一種細(xì)胞培養(yǎng)基，適用于培養(yǎng)數(shù)量有限的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。BioExpress 6000® 是一種化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其配方以 DMEM 為模型，因此非常適合培養(yǎng) HEK293 細(xì)胞。要確定 BioExpress6000® 是否支持特定細(xì)胞系的生長(zhǎng)，建議先在 DMEM 中培養(yǎng)細(xì)胞。如果 DMEM 支持細(xì)胞的生長(zhǎng)，那么 BioExpress6000 也應(yīng)該起作用。如果細(xì)胞需要存在胎牛血清 (FBS) 或胎牛血清 (FCS)，然后應(yīng)將透析過的 FBS 或 FCS 與 BioExpress 6000® 結(jié)合使用。BioExpress 6000® 以粉末形式提供，并附有復(fù)原說明。通常培養(yǎng)基含有 CaCl，但是，CIL 提供了一種不含 CaCl2 的版本，用于非粘附生長(zhǎng)。由于 BioExpress 6000® 是化學(xué)定義的，用戶可以需要標(biāo)記的氨基酸（目錄號(hào) CGM-6500-CUSTOM）。CIL 還提供未標(biāo)記的 BioExpress 6000® 以在購買和使用標(biāo)記版本之前評(píng)估生長(zhǎng)情況。用戶可以需要標(biāo)記的氨基酸（目錄號(hào) CGM-6500-CUSTOM）。CIL 還提供未標(biāo)記的 BioExpress 6000® 以在購買和使用標(biāo)記版本之前評(píng)估生長(zhǎng)情況。用戶可以需要標(biāo)記的氨基酸（目錄號(hào) CGM-6500-CUSTOM）。CIL 還提供未標(biāo)記的 BioExpress 6000® 以在購買和使用標(biāo)記版本之前評(píng)估增長(zhǎng)。

酵母培養(yǎng)基和試劑

酵母是流行的用于蛋白質(zhì)表達(dá)的真核細(xì)胞類型。酵母細(xì)胞易于生長(zhǎng)、遺傳操作，并且可以產(chǎn)生高產(chǎn)量的表達(dá)蛋白。用于生產(chǎn)用于 NMR 目的的標(biāo)記蛋白質(zhì)的三個(gè)屬是畢赤酵母屬、酵母屬和克魯維酵母屬。Cambridge Isotope Labs 很高興為酵母表達(dá)和培養(yǎng)基提供各種標(biāo)記碳源。

葉酸循環(huán)

葉酸代謝途徑在許多生理過程（例如氧化還原和氨基酸穩(wěn)態(tài)）和生化反應(yīng)中起著核心作用。反應(yīng)包括但不限于核苷酸和氨基酸（例如甲硫氨酸、高半胱氨酸）的合成和線粒體蛋白質(zhì)翻譯。受抑制或異常的功能與全身性疾?。ɡ缧难芗膊　⑸窠?jīng)退行性疾?。┯嘘P(guān)。為了協(xié)助化合物識(shí)別/量化及其功能評(píng)估，CIL 提供了一系列與葉酸循環(huán)相關(guān)的代謝物。產(chǎn)品中包括代謝物 5-甲基-四氫葉酸（5-甲基-THF），它與蛋氨酸循環(huán)有關(guān)，以及其他代謝中間體和反應(yīng)物。這些主要以其整潔的形式作為研究級(jí)材料提供。

糖酵解

糖酵解是在 10 步反應(yīng)中將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的代謝途徑，同時(shí)利用釋放的能量進(jìn)行細(xì)胞代謝。這種分解代謝途徑是普遍存在的，發(fā)生在原核和真核細(xì)胞中。為了補(bǔ)充該途徑中代謝物的分析，CIL 很高興提供許多其穩(wěn)定同位素標(biāo)記的化合物。該化合物產(chǎn)品包括途徑終點(diǎn)（即葡萄糖和丙酮酸）及其中間體（例如，6-磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖、3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸）。這些化合物是研究級(jí)的，主要以純凈形式提供。

類固醇和激素

類固醇激素在許多生理過程（例如，水和電解質(zhì)平衡）的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。這組化合物分為 5 個(gè)主要類別：雄激素（例如二氫睪酮、睪酮）、糖皮質(zhì)激素（例如雄烯二酮、脫氧皮質(zhì)醇）、鹽皮質(zhì)激素（例如醛固酮）、雌激素（例如雌二醇、雌酮）和孕激素（例如，孕酮）。類固醇激素的準(zhǔn)確定量對(duì)于基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究至關(guān)重要，可以通過將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的類固醇標(biāo)準(zhǔn)用于液相色譜 (LC-) 或氣相色譜 (GC-) 質(zhì)譜方法來實(shí)現(xiàn)。

CIL 以純凈和/或溶液形式提供未標(biāo)記和穩(wěn)定同位素標(biāo)記的甾體激素。請(qǐng)?jiān)谙路讲榭次覀兊念惞檀技に氐目捎眯?、價(jià)格和規(guī)格，并詢問是否需要更多信息或替代產(chǎn)品/標(biāo)簽。其他資源是用于代謝研究的穩(wěn)定同位素標(biāo)記產(chǎn)品目錄。

代謝同位素分析利用穩(wěn)定的同位素豐富的底物和質(zhì)譜法來研究活細(xì)胞和組織的新陳代謝。由于同位素標(biāo)記的底物可以確定活細(xì)胞或組織中的代謝途徑和通量，mia 已經(jīng)成為腫瘤學(xué)研究的一個(gè)整合平臺(tái)。這個(gè)應(yīng)用說明提供了一個(gè)用于研究小鼠代謝和培養(yǎng)人類細(xì)胞的例子，用于腫瘤學(xué)研究，總結(jié)了 nicolay 等人以前進(jìn)行的研究，這些研究人員利用 mia 來研究蒼蠅模型中的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白抑癌基因(prb)的失活。在提交的研究中，nicolay 和他的同事發(fā)現(xiàn)，成年小鼠組織中 prb 的急性缺失導(dǎo)致了葡萄糖氧化的快速變化(nicolay 等，2015)。這一隨后的研究表明，葡萄糖衍生的中間物在血液循環(huán)的線粒體在 prb-/-組織的功能低于 prb +/+ 組織。這些效應(yīng)在 prb 缺失的人類細(xì)胞培養(yǎng)模型中被模仿。13c6-葡萄糖(cil 目錄編號(hào): 1)的體內(nèi)同位素分析。Clm-1396)在結(jié)腸和肺部使用類似于以前發(fā)表的工作的協(xié)議進(jìn)行(范等人，2011; 萊恩等人，2011; yuneva 等人，2012; sellers 等人，2015)。簡(jiǎn)單地說，給小鼠注射13c6葡萄糖，20分鐘后處死小鼠進(jìn)行組織分離。最初的時(shí)間進(jìn)展分析發(fā)現(xiàn)，注射20分鐘后，血液中13c6-葡萄糖的水平已經(jīng)達(dá)到高峰，并且在糖酵解和 tca 循環(huán)的下游中間環(huán)節(jié)中持續(xù)了13c 的富集(圖1a-d)。以確定 rb +/+ 和 rbko 小鼠的葡萄糖清除率相似, 13c6- 葡萄糖濃度相同的葡萄糖耐量試驗(yàn)(gtt)顯示，誘導(dǎo)后96 hrsafre 基因型之間沒有差異(圖1e)。這些對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，用這個(gè)方法可以確定葡萄糖代謝產(chǎn)物的質(zhì)量差異。為了支持 gtt 的結(jié)果，對(duì)血清中13c6-葡萄糖攝取的分析顯示 rb +/+ 和 rbkotolon 或肺組織之間沒有差異(圖2a)。相反，rb1的缺失引起兩組織中 m + 2檸檬酸鹽的顯著富集(雙倍)(圖1f)。組織中 m + 3丙酮酸或 m + 3乳酸的產(chǎn)生量沒有差異(圖1g，h)。有趣的是，在 rb1丟失后并沒有發(fā)現(xiàn)糖酵解增加(丙酮酸和乳酸的產(chǎn)生表明了這一點(diǎn)(圖2b，c))。這個(gè)奇怪的結(jié)果表明，紅細(xì)胞組織增加了葡萄糖進(jìn)入 tca 的濃度。與此一致的是，一種定性測(cè)定丙酮酸脫氫酶(pdh)活性(m + 2檸檬酸/m + 3丙酮酸)的比率在 rb1丟失時(shí)顯著升高(圖1i)。此外，在兩個(gè) rbko 組織中均觀察到 m + 2乙酰輔酶 a 明顯富集，在 rbko 肺組織中總乙酰輔酶 a 明顯增加(圖1j-k)。用這種方法我們不能直接定量測(cè)定 tca 循環(huán)活性。盡管如此，結(jié)果表明 prb 在體內(nèi)的丟失并不會(huì)產(chǎn)生糖酵解表型，盡管進(jìn)入 tca 循環(huán)的葡萄糖增多，但在相對(duì)高能條件下，atp 的產(chǎn)量卻下降了。引人注目的是，rbko rpe 細(xì)胞表現(xiàn)出明顯增加的充實(shí) m + 2檸檬酸鹽(圖3a)。這種效應(yīng)再次與圖1。體內(nèi)13c6-葡萄糖分析 rb 的丟失對(duì) tca 循環(huán)進(jìn)入的影響。(a)13c6-葡萄糖命運(yùn)通過丙酮酸氧化作用繪制 tca 循環(huán)圖，紅圈為13c，開放圈為12c。丙酮酸*由13c 組成，標(biāo)記為 m + 3。使用的縮寫是: accoa-乙酰輔酶 a; alphakg-α- 酮戊二酸; co2-co2-succinate; mal-malate; fum-fumarate; oac-oxaloacetate; pyr-pyruvate。(b-d)對(duì)照組小鼠血液和組織中13c6- 葡萄糖鏈的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，13c6- 葡萄糖注射后的時(shí)間點(diǎn)(i/p) ，小鼠血液或組織中13c6- 葡萄糖的富集率為9-24。(b)13c6葡萄糖從血液中清除的動(dòng)力學(xué)。(c-d)13c6-葡萄糖氧化為糖酵解(m + 3丙酮酸鹽)和檸檬酸三鈣循環(huán)(m + 2檸檬酸鹽)中間體的動(dòng)力學(xué)。數(shù)據(jù)趨勢(shì)是結(jié)腸和肺組織的代表; 顯示為結(jié)腸樣本的數(shù)據(jù)。(e)糖耐量試驗(yàn)(gtt)顯示 rb 丟失后96h 小鼠基因型間葡萄糖吸收相似，n = 4小鼠/基因型。(f-h) rb 損失使結(jié)腸和肺中13c6葡萄糖衍生物升高，但不影響13c6葡萄糖衍生物丙酮酸或乳酸鹽，n = 8小鼠。(i) pdh 活性比(m + 2檸檬酸/m + 3丙酮酸)。Rb 丟失會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸和肺部 pdhactivity 升高。(j-k) rb 的丟失增加了葡萄糖衍生的乙酰輔酶 a 的富集，增加了乙酰輔酶 a 的總庫。(l) rb 的損失影響體內(nèi)的 atp 水平。誤差線是95% 的置信區(qū)間。P 值的統(tǒng)計(jì)顯著性如下: * < 0.05，* * < 0.02，* * < 0.001。Rb-/-和對(duì)照細(xì)胞的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

Pdh 活性升高的比率(圖3b)。這些結(jié)果表明 rb/rb1消融同樣影響小鼠和人睪丸組織丙酮酸氧化，而且這種變化與 rb/rb1消融對(duì)細(xì)胞增殖的影響無關(guān)。與細(xì)胞內(nèi)分析不同，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中13c6葡萄糖的24小時(shí)脈沖，會(huì)產(chǎn)生非標(biāo)記的13c 檸檬酸鹽。由此我們估算了檸檬酸 m + 4/m + 2之間的 tcacycle 活性。M + 4檸檬酸代表13c 濃縮檸檬酸通過 tca 循環(huán)的第二個(gè)過程(圖1a)。因此，一個(gè)更大的比例將反映一個(gè)加速的 tca 周期。Rb1的丟失嚴(yán)重降低了這個(gè)比率(圖3c) ，證實(shí)了這些細(xì)胞的 tca 周期確實(shí)減少了。由于谷氨酰胺在體外的 tca 循環(huán)中也是一個(gè)大的碳氧化來源，我們對(duì)13c5- 谷氨酰胺衍生的 tca 中間體進(jìn)行了類似的加脂處理，我們發(fā)現(xiàn)在 rbko rpe 細(xì)胞中13c5- 谷氨酰胺的氧化作用也減弱了(圖3d)。鑒于 rb1突變導(dǎo)致線粒體容量下降，我們測(cè)試了這些變化是否會(huì)造成細(xì)胞易感性。因此，我們將對(duì)照 rpe 和 rbko rpe 細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)，葡萄糖濃度從5mm 降低到1mm。令人印象深刻的是，與對(duì)照細(xì)胞相比，這種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移本身導(dǎo)致 rbko rpe 細(xì)胞的生長(zhǎng)減少了50% (圖3e)。加用兩種不同的氧化磷酸化抑制劑(魚藤酮和苯乙雙胍，兩種 ci 抑制劑)進(jìn)一步降低 rbko rpe 細(xì)胞與同樣處理的對(duì)照細(xì)胞相比的活性(圖3 f)。這些結(jié)果有力地支持了 rb/rb1的喪失會(huì)損害氧化磷酸化能力的結(jié)論，并表明線粒體的變化具有生理后果。關(guān)于研究方法和進(jìn)一步的研究細(xì)節(jié)，請(qǐng)參閱 pubmedpmd: 26314710。

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