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媒體

1. 混合 B27 補充劑 / Neurobasal 培養(yǎng)基 / 0.5 mM 谷氨酰胺后，培養(yǎng)基能穩(wěn)定多久？

我們在 4 o C 的黑暗中儲存長達(dá) 6 個月。

2. 我需要多久補充一次 Neurobasal/B27/谷氨酰胺？

我們每 3 到 4 天更換 1/2 培養(yǎng)基，但這部分取決于細(xì)胞密度。參見 INVITROGEN (LTI) FOCUS 16:6。如果細(xì)胞密度高于 500/mm 2  ，則每 2 天更換 1/2。

3. 我可以用一些 B27/Neurobasal + 谷氨酰胺（無谷氨酸鹽）稀釋 BrainBits 附帶的 B27/Neurobasal + 谷氨酰胺 + 谷氨酸鹽，比如 1:2 稀釋，細(xì)胞仍然生長嗎？

是的，但也不是。請參閱上面引用的 FOCUS 文章。

4. 您通常在培養(yǎng)第 4 天之前向 Neurobasal/B27 添加 25 uM 谷氨酸鹽。谷氨酸的目的是什么？

它幫助海馬神經(jīng)元發(fā)芽并促進(jìn)活力。

5. 不加谷氨酸有問題嗎？

在 4 DIV 時，您的存活率將降低約 30%。

6. 我需要一些培養(yǎng)基或試劑來維持培養(yǎng)物嗎？

您將需要您選擇的鍍膜玻璃或塑料基板。該訂單包括足夠的培養(yǎng)基來開始培養(yǎng)并維持 4 或 5 天。除此之外，您將需要更多培養(yǎng)基，我們可提供完整的即用型 NbActv1 配方，并通過 Invitrogen 單獨提供。

7. 我應(yīng)該用抗生素/抗真菌劑補充 B27/Neurobasal 培養(yǎng)基嗎？例如：pen/strep/fungizone 或慶大霉素？

我們通常在不使用抗微生物抗生素和抗真菌劑的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，并取得了良好的效果。這具有三個優(yōu)點：

首先，當(dāng)出現(xiàn)污染時，更容易確定污染源。其次，如果您使用抗生素，當(dāng)您感染時，就更難擺脫。第三，抗生素已被證明可以激活神經(jīng)元中的癲癇樣爆發(fā)活動。然而，我們有時會在慶大霉素 (10 ug/ml) 中開始培養(yǎng)，并在細(xì)胞粘附后一小時后將其沖洗干凈。

休眠®

*Hibernate、Neurobasal 和 B27 僅用于研究目的，由 Invitrogen Corporation 制造。Hibernate、Neurobasal 和 B27 是 Invitrogen Corporation 的商標(biāo)。

1. 我可以使用Hibernate進(jìn)行木瓜蛋白酶治療嗎？

BrainBits LLC 提供 5 ml 不含 B27 的 Hibernate-Ca，用于在 15 ml 無菌離心管中以最佳方式將 BrainBits 與木瓜蛋白酶解離。添加木瓜蛋白酶 (Worthington) 后，在 37 o C 下溶解10 分鐘。您需要使用 0.2 µm 過濾器對溶液進(jìn)行消毒。

2. 你是否總是在 Hibernate 中添加 B27 谷氨酰胺，或者它是否仍然在 Hibernate 中保持細(xì)胞存活？

幾乎總是。請參閱 Brewer and Price (1996) PM:8856709 的圖 1 在 37 0 C 環(huán)境 CO2 中，Neurobasal/B27/gln 中的 LD50 為 24 小時，休眠/B27/gln 中為 >3 天。

3. 我們可以提供不含葡萄糖和丙酮酸的 Hibernate 嗎？

是的，事實上我們有幾個客戶提出了這個要求。因此，我們可以以相同的價格提供不含葡萄糖和丙酮酸的 Hibernate A。您只需要告訴我們您是希望用 NaCl 將滲透壓調(diào)整到正常水平還是低于平常水平，以便您可以自行調(diào)整。

4.  Hibernate 的其他用途包括：

轉(zhuǎn)基因小鼠基因分型過程中的大腦儲存

將腦組織運送給合作者

基質(zhì)

1. 我不經(jīng)常使用聚-D-賴氨酸。我制作了 5 毫克/毫升的 (100x) 儲備溶液并將其等分到小冷凍管中。我可以將原液冷凍保存多久，并且仍然可以與海馬細(xì)胞一起使用？

大概是永遠(yuǎn)。不要儲存在聚丙烯管中。聚苯乙烯或 PET 更好。解凍時一定要攪拌均勻。

2. 一些研究人員使用聚乙烯亞胺代替聚賴氨酸。一個比另一個有優(yōu)勢嗎？

PEI 比聚賴氨酸便宜。我們使用 PEI 并沒有取得多大成功，但 Mark Mattson 在開始在 Neurobasal/10% 血清中培養(yǎng)后一直使用它。報告表明神經(jīng)元存活率或尖峰率沒有顯著差異。

Soussou WV、Yoon GJ、Brinton RD、Berger TW (2007) 在表面處理的多電極陣列上培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)。IEEE 跨生物醫(yī)學(xué)工程 54：1309-1320。 電話：17605362

Brewer GJ, Cotman CW (1989) 海馬神經(jīng)元在低密度限定培養(yǎng)基中的存活和生長：夾心培養(yǎng)技術(shù)或低氧的優(yōu)勢。大腦研究 494:65-74。電話：2765923

3.  BrainBits 神經(jīng)元越來越多地生長為細(xì)胞簇或團塊，而不是孤立的。怎么了？

這意味著細(xì)胞與自身的粘附比與基底更緊密。最可能的問題是基材準(zhǔn)備不充分。將您的方案與推薦的聚賴氨酸制備和基材涂層進(jìn)行比較。

4. 關(guān)于聚-L-賴氨酸與聚-D-賴氨酸，我假設(shè)使用聚-D-賴氨酸，因為如果它分解成賴氨酸，細(xì)胞就不能使用d-賴氨酸。有什么道理嗎？

這就是理論。在一些早期研究 (Brain Res. 494:65(1989)) 中，我們發(fā)現(xiàn)差異很小。

BRAINBITS® 紙巾

1. 我假設(shè) BrainBits 來自新生動物？

除非另有說明，否則它們來自胚胎第 18 天的大鼠。

2. 皮層培養(yǎng)不包括海馬體，對嗎？

他們可以，但我們準(zhǔn)備了沒有丘腦或海馬體的 E18 皮層。我們可以通過特快專遞提供海馬組織或皮質(zhì)組織。這些“BrainBits"允許在 20 分鐘內(nèi)為超過 100 萬個海馬神經(jīng)元或 200 萬個皮質(zhì)神經(jīng)元準(zhǔn)備細(xì)胞，價格為 136 美元。

3. 每個小瓶可以來自皮層和海馬體的神經(jīng)元數(shù)量是多少？

海馬神經(jīng)元的神經(jīng)元數(shù)量>100 萬或皮質(zhì)神經(jīng)元的 200 萬。

4. 海馬神經(jīng)元什么時候表現(xiàn)出興奮性毒性？

乙酰膽堿在我們所知的任何年齡都沒有毒性。

從 E18 海馬培養(yǎng) 7 天開始，谷氨酸的毒性最大。皮層神經(jīng)元可能會提前 1 或 2 天。

5. 你知道你從皮質(zhì)和海馬體中每瓶提供多少個星形膠質(zhì)細(xì)胞嗎？

從海馬開始的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量>100萬，皮層>200萬。

6. 動物腦和脊髓組織是根據(jù) NIH 批準(zhǔn)的方案獲得的，有哪些保證？

BrainBits 動物協(xié)議 #32-08-013 于 11 年 5 月 18 日獲得南伊利諾伊大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物護(hù)理和使用委員會的批準(zhǔn)。

對于 NIH 資助，脊椎動物部分：

保證編號為 A-3209-01

F. 脊椎動物

用于原代培養(yǎng)的海馬、皮層和其他腦和脊髓神經(jīng)元將從胚胎或出生后早期大鼠或小鼠的腦中獲得。在用氟烷（小鼠）或 IP 五巴比醇（大鼠）麻醉后解剖大腦。

通過從動物中分離神經(jīng)元，可以研究比整個動物研究更多的實驗變量，從而減少對動物的需求。大鼠和小鼠的大腦是所有動物大腦中研究得好的。

平均住房需求估計為 2 天，足以讓嚙齒動物從運輸創(chuàng)傷中恢復(fù)過來。動物將由 AALAC 認(rèn)可的 SIUSM Laboratory Animal Medicine 進(jìn)行護(hù)理，并在 Teresa Liberati、DVM、Ph.D. 的指導(dǎo)下?lián)碛?span> 10 名員工，并獲得 ACLAM 認(rèn)證。

用氟烷或麻醉后解剖大腦。因此，這些程序?qū)游锏氖褂孟拗圃谶M(jìn)行具有科學(xué)價值的研究中無法避免的范圍內(nèi)，并最大限度地減少動物的不適、痛苦和疼痛。

用氟烷麻醉后將解剖大腦。將用于大鼠的心臟。小鼠將在麻醉下斷頭臺。這些方法符合美國獸醫(yī)協(xié)會小組的建議。

7.  BrainBits, LLC 能否從我們胚胎大鼠和小鼠的懷孕母親那里獲得解剖區(qū)域？

BrainBits 可以從我們胚胎大鼠或小鼠的懷孕母親那里提供大腦皮質(zhì)。這是一個建議的協(xié)議，供您評估是否要嘗試此操作。請告訴我們您是否以及何時希望 BrainBits 開始向您發(fā)送成人皮質(zhì)以分離內(nèi)皮細(xì)胞。

Wolburg H、Neuhaus J、Kniesel U、Krauss B、Schmid EM、Ocalan M、Farrell C、Risau W (1994) 血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。組織培養(yǎng)、第二信使和共培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。J Cell Sci 107（第 5 篇）：1347-1357。 電話：1692329

Risau W、Engelhardt B、Wekerle H (1990) 血腦屏障的免疫功能：體外大鼠腦微血管內(nèi)皮對蛋白質(zhì)（自身）抗原的不*呈遞。J Cell Biol 110:1757-1766。 電話：7929640

有關(guān)從脊髓中分離運動神經(jīng)元的更多信息 M. Das、JW Rumsey、N. Bhargava、M. Stancescu 和 JJ Hickman。定義的長期體外神經(jīng)肌肉接頭組織工程模型。生物材料 31 (18):4880-4888, 2010.  PM:20346499

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解散

1. 通過結(jié)核菌素注射器上的 18 或 20 號針頭研磨組織是否有問題？

是的。針的邊緣太鋒利了。1 ml 移液管的藍(lán)色塑料吸頭更好，但好的是火焰拋光的 9 英寸巴斯德移液管，該吸管之前經(jīng)過硅烷化處理。確保吸頭開口的直徑至少為 1 毫米。

2. 海馬或皮層細(xì)胞的活力是否取決于解離方法？你更喜歡機械解離還是酶解離？

是的，使用木瓜蛋白酶可以獲得更高的活產(chǎn)率（參見 J Neurosci Meth 71:143），但表面蛋白的消化是不可避免的。短期（少于 4 天）這是一個問題。從長遠(yuǎn)來看，它可能并不重要。使用火拋光的 9 英寸玻璃移液管獲得更高的生存能力，使用藍(lán)色塑料移液管獲得更低的生存能力。對于 E18 組織，我們使用機械來提高速度和簡單性。

3. 您是否使用酶來制備皮質(zhì)培養(yǎng)物？

為了獲得更高的產(chǎn)量，我們使用 在不含 B27 的H ibernate E-Ca 中稀釋的 2 mg/ml木瓜蛋白酶溶液 。該溶液應(yīng)在 30 o C 水浴中孵育10 分鐘。不應(yīng)在此溶液中添加其他化學(xué)品，例如 EDTA、巰基乙醇或半胱氨酸-HCl。有關(guān)其他信息，請參閱我們的 原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)方案 。

4. 您為什么推薦不含 B27 的 Hibernate-Ca 以實現(xiàn)與木瓜蛋白酶的最佳解離？

鈣促進(jìn)粘附。因此，去除鈣會促進(jìn)神經(jīng)元的解離。為了提供細(xì)胞粘附蛋白作為木瓜蛋白酶的主要底物，B27 被省略，因此 B27 中的蛋白質(zhì)不會競爭底物。

文化

1. 細(xì)胞能存活多少代和多長時間？

如果您每 3-4 天以一半的培養(yǎng)基體積變化來喂養(yǎng)細(xì)胞，它們將持續(xù)數(shù)月。由于它們不會繁殖，因此通過它們是沒有意義的。

2. 它包含多少個星形膠質(zhì)細(xì)胞？

海馬體 BrainBits 中的星形膠質(zhì)細(xì)胞少于 5%。皮質(zhì) BrainBits 可能有大約 10% 的星形膠質(zhì)細(xì)胞。如果你在血清中培養(yǎng)，你會得到更多。我們推薦在 B27/Neurobasal (Invitrogen/GIBCO) 中培養(yǎng)。這抑制了沒有 AraC 的神經(jīng)膠質(zhì)生長。

3. 我什么時候應(yīng)該添加 Ara-C 作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂抑制劑？

在我們推薦的 Neurobasal/B27 培養(yǎng)基中，您根本不需要添加 Ara-C。該培養(yǎng)基不像血清那樣人為地刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。嘗試一下！

4. 我用 BrainBits 開始的培養(yǎng)物被污染了。開始時它們看起來很好，但現(xiàn)在介質(zhì)是混濁的黃色，有許多 1-3 um 長的相暗體。

至少有 5 種可能的污染源（假設(shè)您的培養(yǎng)箱中的其他培養(yǎng)物沒有受到污染，并且培養(yǎng)箱底部的加濕水是清澈的）：

培養(yǎng)容器本身。通過將新鮮過濾的培養(yǎng)基添加到多個培養(yǎng)容器中進(jìn)行控制。

粘合劑基材。這并不少見。BrainBits 已準(zhǔn)備好無菌底物蓋玻片供您測試。您還可以將新鮮過濾的培養(yǎng)基放在準(zhǔn)備好的基質(zhì)上，以尋找這種污染源。

培養(yǎng)基本身或其添加劑之一（例如，谷氨酰胺）。這并不少見。確保在您的培養(yǎng)基的未涂層孔中進(jìn)行單獨的測試，并由 BrainBits 提供。

看似隨機或低水平的污染可能來自于朝著開放文化的方向說話甚至呼吸。此外，無菌罩和培養(yǎng)箱之間的空氣不是無菌的，大多數(shù)培養(yǎng)容器沒有密封。如果引擎蓋到培養(yǎng)箱的距離很遠(yuǎn)，您可以將您的培養(yǎng)物放在已用 70% 乙醇沖洗過的塑料食品容器中。

BrainBits 組織。盡管我們對我們提供的培養(yǎng)基進(jìn)行了無菌測試，但無法對組織本身進(jìn)行測試。如果您能提供證據(jù)證明您的 BrainBits 組織按時到達(dá)并在 4 攝氏度下儲存直至使用，并且上述 4 種可能性已被排除，請致電我們進(jìn)行一次性更換。通常，我們的經(jīng)驗是您的樣品是我們本周所有貨物中受到污染的樣品，因此請理解我們需要進(jìn)行上述測試。

5. 我想知道您是否可以建議我需要接種多少個細(xì)胞才能獲得足夠的蛋白質(zhì)用于幾次蛋白質(zhì)印跡，即多少個細(xì)胞等于 20-50 ug 蛋白質(zhì)？

根據(jù) Patel 和 Brewer (2003) 的說法，在培養(yǎng)中生長一周的每 18,000 個細(xì)胞含有約 6 微克蛋白質(zhì)。因此，3000 個細(xì)胞/微克蛋白質(zhì)。需要約 50 微克蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡提取物將需要約 150,000 個細(xì)胞。

冷凍細(xì)胞

1. 我嘗試用 1:1 稀釋來自新鮮解凍的冷凍神經(jīng)元的臺盼藍(lán)進(jìn)行活力染色。所有細(xì)胞似乎都染成淡藍(lán)色。

這是可以預(yù)料的，因為冷凍保護(hù)劑會部分滲透膜。非常輕柔地處理這些剛解凍的細(xì)胞。在培養(yǎng)幾個小時后或肯定在 15 小時后，與競爭對手的冷凍細(xì)胞相比，這些細(xì)胞中有更多的細(xì)胞將*排除臺盼藍(lán)作為生存力的指示。您還可以嘗試使用 5 ug/mL 的紅色熒光染料碘化丙啶對死細(xì)胞進(jìn)行染色。

NBACTIV4®

1. 你能告訴我關(guān)于生長條件的改善以及我需要哪些補充劑（例如谷氨酰胺等）來用這種新培養(yǎng)基培養(yǎng)和生長初級 E18 皮質(zhì)神經(jīng)元？

您可以像通常使用 Neurobasal/B27 和 0.5 mM Glutamax 的混合物一樣使用新培養(yǎng)基，因為所有這些成分都在新混合物中 + 3 種新成分；膽固醇、雌激素和肌酸。

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預(yù)涂培養(yǎng)瓶

1. 你能推薦任何品牌的預(yù)涂組織培養(yǎng)瓶或制備用于原代神經(jīng)元生長的組織培養(yǎng)瓶的方法嗎？

BrainBits 已確定細(xì)胞培養(yǎng)塑料或玻璃上的聚賴氨酸涂層在涂層后 2 天內(nèi)開始失效。我們懷疑一些預(yù)涂板的效果令人滿意，但我們的經(jīng)驗是，其中一些導(dǎo)致原代神經(jīng)元的粘附和存活不佳。因此，我們建議您涂上自己的基材并在一天內(nèi)使用它們，如提供的協(xié)議中所述。

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祖先

1. 為什么我會立即看到集群形成？

以 30,000/cm 2接種細(xì)胞 將導(dǎo)致快速簇形成。如果沒有附著，它們將作為前體留在 Neuropro 中并長成可在 4-7 天內(nèi)收獲的神經(jīng)球。4 天后可以開始對巢蛋白或其他抗體進(jìn)行免疫染色評估。要查看克隆生長，您可以將原始樣品或這些神經(jīng)球以 50 個細(xì)胞/cm2 的組織培養(yǎng)塑料或超低粘附塑料的有限稀釋度鋪在同一培養(yǎng)基中。

為了觀察多能性，在涂有聚-d-賴氨酸（50 微克/毫升水）的基材上以 5 到 15,000 個細(xì)胞/cm2 的濃度將神經(jīng)球平板分離。

2. 我應(yīng)該接種單個細(xì)胞來做神經(jīng)球檢測嗎？

不，神經(jīng)球包含一組細(xì)胞。您可以將它們固定并作為簇染色或用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶將它們分離，計數(shù)以確定產(chǎn)量和/或固定以評估單個細(xì)胞。

3. 接種后細(xì)胞為單個細(xì)胞，但今天已形成簇。一些集群的大小非常大。這是正確的標(biāo)志嗎？

是的。

4. 我應(yīng)該觀察神經(jīng)球的形成來評估細(xì)胞的祖細(xì)胞階段嗎？

不，至少等待 4 天。

5. 如何區(qū)分神經(jīng)球和簇？

您可以將神經(jīng)球傳遞到低粘附性塑料或粘附性表面上并觀察差異。只要細(xì)胞在低粘附性塑料上，它們就會作為祖細(xì)胞留下。

6. 這個階段需要做免疫染色嗎？

至少等待 4 天。

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